En 1613 gana la plaza de Maestro de capilla de la Iglesia Colegial de Jerez de la Frontera (Cádiz). Una vez ordenado sacerdote consigue este mismo cargo en la Catedral de Cádiz, de 1616 a 1620.

No se sabe cuándo embarcó hacia América, al en aquel entonces Virreinato de Nueva España, pero en 1622 ya estaba en Puebla de los Ángeles, en México, que en tiempos Barrocos era un centro religioso más grande que la misma Ciudad de México. Gaspar Fernandes, Maestro de capilla de la Catedral poblana, era ya mayor y recomendó al Cabildo catedralicio que se contratara a Padilla como Cantor y ayudante del Maestro, con las obligaciones de dirigir el Coro, componer obras (poner y apuntar las chanzonetas) y dar clases de Canto de órgano (polifonía) a los cantores de la Catedral. Por ello cobraba un salario de 500 pesos, bastante elevado para la época, pero su trabajo era muy apreciado por el Cabildo.

Al morir Gaspar Fernandes en 1629, el Cabildo unánimemente da a Padilla el cargo de Maestro de Capilla vacante. Por sus méritos, "buenos servicios" y "grande aprovacion y aprovechamiento de los demas ministros" consigue un aumento de salario y obtiene en 1630 una Ración Eclesiástica.

Hay un pequeño misterio de su vida: fue despedido "por causas justas" (aunque no mencionadas en los documentos) en 1634. Y a los dos meses fue readmitido, por petición y súplica de otros canónigos de la Catedral.

Desde que accedió al Magisterio de capilla no volvió a dar clases de "canto de órgano", por lo que era reconvenido a menudo. Hasta 1634, en que se le liberó de tal labor "por estar muy ocupado en sus quehaceres", con lo que se tuvo que nombrar a otros dos maestros, para canto llano y para canto de órgano. Aún así se intentó en varias ocasiones que el Maestro de capilla volviera a tomar estas responsabilidades.

No sólo trabajó en la Catedral, sino que también se solicitaron sus servicios al frente de la Capilla de Música para festividades fuera de la Catedral, así en el Convento de la Santísima Trinidad y por parte del mismo Ayuntamiento de la ciudad.

El trabajo en la Catedral no impidió que Padilla tuviera otras inquietudes intelectuales. Así se tiene noticias de que hacia 1628 obtuvo el grado de Bachiller en el Colegio de San Ildefonso de Puebla, y en 1641 obtuvo el grado de Licenciado. Desde 1663 la salud de Padilla fue resintiéndose, hasta su muerte, cuando el "distinguido Maestro de la Nueva España" fue enterrado en la iglesia del Sagrario de Puebla.

Las obras de Gutiérrez de Padilla tuvieron una gran fama ya en su tiempo, teniendo noticias de que se llegaron a interpretar sus obras en Guatemala y Lisboa, en la corte de Alfonso VI. La mayoría de su inmensa producción (más de 700 piezas sobreviven) incluye motetes sacros, a menudo para coro doble, en el estilo del Renacimiento o stile antico así como villancicos sacros. Incluye a menudo acompañamientos de órgano o varios instrumentos de cuerdas.

El aprecio y estima que se tenía del valor de las obras de Padilla hizo que en dos ocasiones el Cabildo de la Catedral decidiera conservarlas, mandándolas encuadernar y guardar en un lugar especial del archivo, en 1656 y en 1663. Esto es significativo, especialmente en lo referente a las chanzonetas y villancicos, que por su carácter no litúrgico no se solían conservar más que para un solo uso.
Gracias a esto se conservan 44 obras litúrgicas en latín, entre las que destacan cinco Misas, dos Lamentaciones, una Pasión, motetes y salmos.

Y lo más destacable, sus villancicos en castellano, de los que se conservan más de sesenta, y entre ellos ocho ciclos completos de Villancicos para los Maitines de Navidad. También hay villancicos para otras festividades, como Corpus Christi, Inmaculada Concepción y San Lorenzo.

Las obras de Padilla se conservan principalmente en el Archivo de la Catedral de Puebla, en la Colección "Sanchez Garza", actualmente en el CENIDIM (Centro Nacional de Investigación, Documentación e Información Musical de México) y en la colección de Hackenberry en Chicago, Illinois. Su "Missa Ego Flos Campi" ha sido grabada recientemente.